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禽流感高免卵黄抗体的研究

更新时间:17/01/17 12:48:01     来源:威尼斯最新网址关闭分    享:
禽流感是由流感病毒引起的一种烈性传染病,对养禽业构成了严重的威胁。将禽流感病毒油乳剂灭活苗按一定的免疫程序给SPF蛋鸡强化免疫,制备抗禽流感的高免卵黄液,用于治疗禽流感取得了一定的效果。但粗制卵黄液中含有大量脂类及其他的杂蛋白,用于治疗时存在注射困难,吸收不良,过敏反应,保存期短和运输不便”。因此,我们对禽流感高免卵黄抗体进行了纯化研究。
1 材料与方法
1.1 疫苗 禽流感油乳剂灭活苗,中牧股份实业有限公司郑州生药厂,批号030444。
1.2 禽流感抗原 山西省兽医防治站提供。
1.3试验用动物 购自山东省家禽研究所的200日龄SPF产蛋鸡和20日龄SPF小鸡、太谷县某养鸡场200日龄非免疫产蛋鸡30只及健康小鼠10只。
1.4 免疫方法 SPF产蛋鸡肌注禽流感油乳剂灭活苗1mL,首免后7~10d再次用该苗2mL进行二免,二免后每隔3d用HI测定其卵黄效价,当卵黄效价达2E10以上即可收集鸡蛋,用于制备卵黄液。以后每隔一定时间强化免疫1次,保证卵黄效价。
1.5 卵黄液的制备 选择卵黄效价达2E10以上的高免蛋,分离蛋黄与灭菌蒸馏水按1∶1稀释,充分搅拌,保存备用。
1.6 1gY的纯化 制备好的卵黄液中加入相当与原卵黄体积8倍、4℃预冷的酸性蒸馏水,边加边搅拌,4℃保温静置过夜,取上清液,上清液用滤布过滤,过滤液进行超滤浓缩,浓缩倍数为4,所得超滤液中加入硫柳汞至终浓度为0.01%,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,即为精制禽流感高免卵黄抗体。
1.7 抗体效价检测采用血凝抑制试验。
1.8 无菌检验 2.0mL精制禽流感高免卵黄抗体分别接种普通琼脂培养基、血液琼脂斜面和厌氧肉汤中,37℃培养48h,观察有无细菌生长。
1.9 安全试验 健康小鼠10只,每只皮下注射本品1mL;20日龄SPF小鸡10只,每只皮下注射本品5mL,观察2周。
1.10 动物试验 取200日龄非免疫产蛋鸡30只,随机分为3组,第1组为健康对照组,不注射任何药物,隔离饲养。第2和第3组每只鸡肌注、点眼、滴鼻接种EID50AIV种毒0.2mL。攻毒后24h分别给第2组鸡皮下注射本品2.0mL,第3组皮下注射生理盐水2.0mL。观察10d,记录每组鸡发病、死亡情况。
1.11 脱脂率与蛋白质回收率的测定用紫外分光光度计测定精制禽流感高免卵黄抗体在A280和A260处的吸光度,按紫外吸收差法测定蛋白质的含量,计算公式:蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45×A280-0.74×A260)。脂肪含量测定采用香草醛显色法。
1.12 保存期试验 将精制禽流感高免卵黄抗体分别保存在室温4℃和~20℃,每月测定一次HI效价。
2 结果
2.1 物理性状 应为无色或淡黄色液体,放置一段时间后瓶底有少量沉淀,pH值呈中性。
2.2 无菌检验 2.0mL精制禽流感高免卵黄抗体分别接种普通琼脂培养基、血液琼脂斜面和厌氧肉汤中,37~12培养48h,未见有任何细菌生长。
2.3 安全试验 健康小鼠10只,每只皮下注射本品2mL;20日龄SPF小鸡10只,每只皮下注射本品5mL,观察2周,未发现任何异常,精神状态和生长情况良好,证明精制禽流感高免卵黄抗体是安全可靠的。
2.4 动物试验 第1组健康状况良好,无发病死亡。第3组在攻毒后24~48h开始发病,出现死亡,72h全部发病,7d内死亡8只。第2组在注射精制禽流感高免卵黄抗体后12h即攻毒后36h有4只鸡发病,发病后12~24h,其中1只死亡,其余3只均恢复正常。证明该卵黄抗体确实起到了中和病毒的作用。
2.5 脱脂率与蛋白质含量 沉淀中的脂肪经香草醛显色法测定含量为95.7%,精制卵黄抗体中蛋白质含量经紫外吸收差法测定为9.47mg/mL,该纯化卵黄抗体的方法去脂效果好,IgY回收率比较高。
2.6 保存期试验 精制禽流感高免卵黄抗体室温条件下可保存10个月,4~12条件下保存15个月,-20℃条件下保存18个月。
3 小结与讨论
3.1 禽流感是Ⅰ类烈性传染病,一旦发病,将对养鸡业造成严重的威胁,用禽流感油苗免疫蛋鸡制备高免卵黄液,给发病鸡注射,随着抗体的扩散直接中和体内的病毒,使鸡体在短时间内获得迅速保护,发挥了紧急预防和紧急治疗的作用。精制禽流感高免卵黄抗体对200日龄非免疫产蛋鸡及20日龄SPF小鸡安全可靠,有较好的保护作用,在生产实践中可以推广应用。
3.2 卵黄液中含有大量的脂类和杂蛋白,对IgY的吸收造成影响,经过纯化去掉了脂类和杂蛋白,纯化后的IgY不但易于注射,而且易于吸收,治疗效果好。该纯化过程采用水稀释法,在此基础上加以改进,与PEG沉淀法、氯仿抽提法、硫酸钠沉淀法等纯化方法比较,水稀释法成本低,易于操作,实验条件简单,适合工业化生产。
3.3 现已报道有治疗新城疫、法氏囊、禽脑脊髓炎的各种卵黄液,用于治疗相应的疾病,取得了较好的治疗效果。但禽流感亚型众多,变异性极强,所以应进行本地毒株分离,制备油苗免疫,这样制备的卵黄抗体更有针对性,预防和治疗的效果会更好。
3.4 制备卵黄抗体的蛋主要来自普通的产蛋鸡,这样就会造成一些疾病的垂直传播,可以采用非免疫鸡群,排除一些蛋传疾病,也可将制备好的卵黄抗体进行60Coγ射线辐射灭菌,同样可以达到灭菌的目的。
3.5 由于除去了大部分的脂类,精制禽流感高免卵黄抗体的保存期比普通卵黄抗体的保存期延长,给卵黄抗体的运输和贮藏带来了方便。
3.6 从免疫鸡卵黄中提取特异性IgY抗体,是一种预防和治疗动物和人类某些疾病的优质便利的好途径,在生物制品的开发和综合利用方面有广阔的前景,随着对IgY制备和纯化方法的不断改进以及研究的不断深入其应用将进一步扩大。 
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